人体细胞内的钾、钠、氯等离子稳态是受到严格调控的，离子稳态一旦失衡，就会导致高血压、抑郁、癫痫等一系列疾病。而在细胞膜上，有一类被称为阳离子-氯离子共转运蛋白的蛋白质，可以带着离子进入和离开细胞，从而有效调控细胞内的离子稳态。不过长期以来，由于缺乏精确的结构信息，人们对这类蛋白的工作机理还不甚了解。

近日，浙江大学医学院郭江涛课题组解析了这类蛋白质中的一个成员——人源钾-氯共转运蛋白KCC1的2.9埃的高分辨率冷冻电镜结构，揭示了钾离子和氯离子的结合位点，提出一个钾-氯共转运机理的模型，这将为相关的疾病治疗和药物设计提供新的视角。

10月25日，这项研究刊登在国际顶级杂志《科学》（Science）上。浙江大学医学院刘斯博士、冷冻电镜中心常圣海博士和物理系硕士生韩斌铭为文章的共同第一作者。

图1. 人源KCC1的结构。（A）KCC1的二聚体结构；（B）KCC1的钾离子与氯离子结合位点。

为何雾里看花？

一般来说，人体细胞内的钾离子浓度是高于细胞外浓度的。钾-氯共转运蛋白KCC利用这个钾离子浓度梯度，将细胞内的钾离子和氯离子一起转运至细胞外，从而调控细胞内的氯离子浓度。

氯离子浓度是一个很关键的指标。例如，在γ-氨基丁酸介导的抑制性神经传递过程中，抑制性神经元需要维持细胞内较低的氯离子浓度才能发挥正常的抑制作用。正是由于钾-氯共转运蛋白中的一个成员KCC2不停地将细胞内的钾离子和氯离子转运至细胞外，使得抑制性神经元细胞内能够维持较低的氯离子浓度。如果KCC2发生突变，抑制性神经传递就会受到破坏，这样一来神经元会持续放电，从而引发各种神经系统疾病，如癫痫等。

既然KCC的功能如此重要，为何科研人员长久以来都没有揭开这个家族的面纱呢？

郭江涛研究员介绍说，这主要受限于两方面的因素。首先，钾-氯共转运蛋白的样品获得不容易。要想做结构研究，首先得有溶液状态下的大量、均一的蛋白样品。但因为钾-氯共转运蛋白在细胞内的本底含量很低，为了获得大量的蛋白样品，就需要将蛋白的基因包裹在杆状病毒中，用杆状病毒感染大量的哺乳动物细胞进行过量表达。在蛋白纯化过程中，由于钾-氯共转运蛋白是定位于细胞膜上的膜蛋白，具有很强的疏水性，在水溶液中膜蛋白不稳定，易于沉淀，需要溶解在双亲性的去污剂中。因此，钾-氯共转运蛋白的纯化和样品制备的过程比一般的水溶性蛋白更加复杂和困难。蛋白纯化过程就像是大浪淘沙，培养几升的细胞，经过逐步纯化，最终才获得100微克左右的蛋白样品。

另一方面，较小分子量的膜蛋白的高分辨率结构解析一直具有挑战性。如果采用传统的晶体学解析这种膜蛋白结构，通常需要花费几年的时间，而且就算投入大量的人力和经费，最终结果也往往不理想。近年来冷冻电镜技术的发展为解析膜蛋白结构提供了便捷的途径。不过，困难依旧存在。“冷冻电镜通常对分子量大于150千道尔顿（道尔顿为相对原子质量单位，1道尔顿的质量等于1克的6.02×10²³分之一）的蛋白质的结构解析非常有效，分辨率往往在3.5埃左右（1埃等于1米的一百亿份之一）；但对于小分子量蛋白质的高分辨率结构解析仍然比较困难。”郭江涛说，以KCC1为例，最终解析结构的部分的分子量只有120千道尔顿，分辨率为2.9埃，这对于一般的冷冻电镜结构生物学研究来说，是很不容易的。

飞越迷雾把你看清楚

刘斯经过大量的蛋白表达和纯化条件的优化，最终获得足够量的可用于冷冻电镜数据收集的KCC1蛋白样品。此时，浙江大学冷冻电镜中心的300kv的高性能冷冻电镜Titan Krios派上了大用场。

然而，有先进的冷冻电镜，也不一定拍出好照片。生物大分子样品对曝光非常敏感，电子的辐射会让其受损伤。拍照只能在曝光时间短、剂量低的情况下进行，但这也直接导致了拍摄噪音大。“拍到理想的照片真可谓是一波三折，课题组的研究从2017年就开始了，但真正拿到高分辨结构已经是2019年初了。”常圣海说。

为了减少电子对蛋白的辐射损伤，蛋白样品需要在冷冻环境下进行数据收集。这又是个技术活。在数据收集前，科研人员用液态乙烷把蛋白溶液样品快速冷冻在一张“铜网”上。铜网的每个目下面是一个方格，里面有几百个通透的孔，蛋白颗粒就被玻璃态的冰层包裹在这些孔中。但是，问题又来了，一般的冰层厚度在100-200纳米之间，而KCC1蛋白的直径在8-10个纳米之间，就好像要在十几米深的泳池里寻找1米长的目标，噪音很大。

为了提高分辨率，刘斯和常圣海先是“削薄”冰层，然后再不断调整参数，让冷冻后的KCC1蛋白颗粒能够密集而均匀地分布在冰层较薄的区域。这样不仅可以显著降低冰层的噪音，提高分辨率，而且可以增加每张照片的蛋白颗粒数量，提高数据收集效率。

电镜数据收集的过程，有点像电影的拍摄手法：在8秒的时间内连续拍摄40张照片，形成一个“微电影”。科研人员通过图像处理，将微电影“叠加”成一张照片，这样可以显著提高照片的信噪比，获得更为清晰的画面。课题组从3000多部“微电影”中，挑出了一两百万个蛋白颗粒进行数据处理。经过层层筛选，最终用十万个左右的高质量的蛋白颗粒进行高分辨率三维重构。

课题组最终获得了两套2.9埃高分辨率的KCC1的三维结构。 “这项工作首先得益于近年来的冷冻电镜技术的发展；刘斯和常圣海在蛋白样品制备和数据收集处理方面的经验和决心是课题取得进展的关键因素。”郭江涛这样评价道。

令人兴奋的发现

分析了KCC1的高分辨率三维结构后，研究人员发现KCC1是以二聚体的形式存在，它的跨膜区与胞外区均参与了二聚体的形成。在KCC1结构中，研究人员鉴定出一个钾离子和两个氯离子的结合位点；结合离子转运实验、分子动力学模拟、结构比较等方法，该研究阐明了KCC1以1：1的比例同时同向转运钾离子和氯离子的分子机理。

 “阐明分子机理，不仅需要高分辨率三维结构，而且需要离子转运活性实验、分子动力学模拟进行验证。范德比尔特大学的EricDelpire和浙大物理系的李敬源团队在这方面提供了专业的技术支持。”论文的资深作者叶升教授高度评价合作者的工作。

 “物质的跨膜运输是人体细胞与外界进行物质、能量和信息交换的重要途径”，郭江涛介绍说，“在转运钾离子和氯离子的过程中，KCC1就好像细胞膜上有一个旋转门，朝内这一侧的门先打开，离子结合到KCC1上进入旋转门内；然后朝外这一侧的门打开了，离子从旋转门释放到细胞膜外。”

图2. KCC1共转运钾离子和氯离子的模型。第二个氯离子首先结合在第二位点，然后钾离子和第一个氯离子结合；KCC1的构象由内向态向外向态转变，钾离子和第一个氯离子释放至细胞外。

获得了KCC1的高分辨率电镜结构，将有助于下一步设计针对KCC的药物，为治疗癫痫等疾病提供帮助。文章审稿人认为：“这项工作揭示了一个令人兴奋的人源转运蛋白的结构。”

这项研究的主体工作在浙江大学完成，浙江大学冷冻电镜中心为数据收集提供了大力支持。浙江大学医学院的郭江涛研究员整合了德克萨斯大学西南医学中心白晓辰团队、天津大学叶升团队、范德比尔特大学的Eric Delpire团队以及浙江大学物理系的李敬源团队等研究力量，体现了跨学科合作的优势。该工作还得到了浙江大学医学院杨巍教授、冷冻电镜中心主任张兴教授的帮助。该研究受到国家自然科学基金委、科技部重点研发计划等项目的资助。

论文链接：https://science.sciencemag.org/content/366/6464/505

（摄影 卢绍庆 图片来源课题组）